實(shí)驗(yàn)中鎳親和層析影響因素之六聚組氨酸

目的研究六聚組氨酸在重組蛋白中的位置對鎳親和層析的影響。方法采用PCR法擴(kuò)增目的基因,克隆人pMD18-T載體后進(jìn)行序列測定。構(gòu)建原核表達(dá)載體pET28-His-Cpn10-IL4與pET28-Cpn10-His-IL-4,在大腸桿菌菌株BL21(DE3)中表達(dá)兩種在不同位置帶有六聚組氨酸(His-tag)的重組白細(xì)胞介素4(rhIL-4)融合蛋白。用SDS-PAGE、Western印跡鑒定表達(dá)產(chǎn)物,采用鎳親和層析的方法純化兩種重組融合蛋白。結(jié)果Western印跡證實(shí)兩種融合蛋白均可與抗組氨酸單克隆抗體特異性結(jié)合,但用鎳親和層析方法可以很好地分離純化融合蛋白His-Cpn10-IL-4,卻不能純化融合蛋白Cpn10-His-IL-4。結(jié)論應(yīng)用鎳親和層析的方法純化融合蛋白時(shí),His-tag在融合蛋白中的位置對蛋白質(zhì)的純化非常重要,His-tag可以在融合蛋白的N端和C端,但不能在中間。
以交聯(lián)瓊脂糖微球?yàn)榛|(zhì),通過環(huán)氧氯丙烷活化,偶聯(lián)亞胺二乙酸并螯合N i2+,制備得到一種鎳離子親和層析介質(zhì)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在強(qiáng)堿條件下環(huán)氧活化率達(dá)到了38.0μmol/mL,最終N i2+配基密度達(dá)到了30.9μmol/mL,偶聯(lián)效率為81.3%。利用得到的鎳離子親和介質(zhì)對基因工程大腸桿菌表達(dá)的組氨酸標(biāo)記3-羥基丁酮還原酶進(jìn)行了一步層析純化,酶活回收率達(dá)到了58.8%,純化倍數(shù)為2.1,蛋白純度在85%左右,純化效果與常用商品介質(zhì)基本相當(dāng)。
青島科諾賽生物科技有限公司專注于生物分子分離純化，業(yè)務(wù)有蛋白A親和層析,疏水層析，鎳親和，肝素親和，抗體/疫苗/重組蛋白純化等，現(xiàn)擁有研發(fā)及中試實(shí)驗(yàn)室2000平方米，生產(chǎn)基地23000余平方米