寡核苷酸純化解決方案
最新數(shù)據(jù)顯示，2023年1月-11月，國內(nèi)已有31家核酸藥物公司獲融資，總金額近40億元，其中多家公司融資超1億元，核酸藥物領(lǐng)域炙手可熱。（醫(yī)麥客統(tǒng)計，文末附31家公司名單）
作為核酸藥物的代表，小核酸藥物憑借其對疾病遺傳物靶點(diǎn)的直接作用，具有更高的靶向成藥性，而且特異性高、藥效長，表現(xiàn)出極大的潛力。這種獨(dú)特的優(yōu)勢也使其成為研發(fā)和投資領(lǐng)域共同關(guān)注的焦點(diǎn)。
小核酸藥物在合成過程后，會存在多種雜質(zhì)，其中短核苷酸（n-x）或者長核苷酸（n+x）與目標(biāo)產(chǎn)物性質(zhì)非常接近，去除難度較大。如何在去除這些產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)的同時，又能保證較高的收率，對純化工藝來講是非常大的挑戰(zhàn)。
本期文章，我們來了解一下可用于商業(yè)化生產(chǎn)的寡核苷酸純化解決方案。
01 寡核苷酸基本概念
小核酸藥物，英文Oligonucleotide drug，又名寡核苷酸藥物，是由十幾個到幾十個核苷酸串聯(lián)組成的短鏈核酸，通過干預(yù)靶基因表達(dá)，實(shí)現(xiàn)治療疾病的目的。
狹義的小核酸藥物是指siRNA（RNA小干擾藥物）；廣義的小核酸藥物是指：除了siRNA外，也包括ASO（反義寡核苷酸藥物）和miRNA靶向（微小RNA），saRNA（小激活RNA），以及Aptamer（RNA適配體）等。
目前全球的藥物開發(fā)重點(diǎn)主要集中在siRNA和ASO。
02 寡核苷酸生產(chǎn)工藝
小核酸藥物的生產(chǎn)，通常采用化學(xué)合成法，經(jīng)過靶序列篩選、寡核苷酸合成、斷裂和脫保護(hù)、純化、分離等步驟。其中寡核苷酸的合成比較關(guān)鍵，目前市場上多采用亞磷酰胺化學(xué)固相合成法?；瘜W(xué)修飾雖然可以提高藥物穩(wěn)定性，但同時也會帶來雜質(zhì)種類增加、純化難度高的問題，為最終藥品的質(zhì)量和安全帶來隱患。
在寡核苷酸的固相合成過程中，產(chǎn)生的雜質(zhì)種類多樣，包括寡聚物（短核苷酸N-x/長核苷酸N+x）、修飾反應(yīng)的副產(chǎn)物、脫保基不完全產(chǎn)物、缺失嘌呤堿基的寡核苷酸以及其他降解產(chǎn)物等。想要獲取高純度、高質(zhì)量的寡核苷酸，必須使用層析純化去除這些雜質(zhì)。
由于這些雜質(zhì)與目標(biāo)產(chǎn)物的在電荷、分子大小、疏水性能上極為相似，給寡核苷酸的純化帶來了一定的難度，需要用高分辨率的層析介質(zhì)和層析工藝來完成雜質(zhì)與目標(biāo)產(chǎn)物分離的目的。
03 寡核苷酸純化工藝
使用合適的高分辨率層析介質(zhì)和層析工藝，可確保寡核苷酸的質(zhì)量和生產(chǎn)效率。
純化工藝方面，常見的寡核苷酸純化方法是反向?qū)游觯≧P）和陰離子交換層析（AEX），其中，我們更推薦陰離子交換層析（AEX），原因：一是避免了使用高成本含有機(jī)溶劑的洗脫液，無需配備防爆設(shè)備，還可減少廢液處理的費(fèi)用；二是原理簡單，易于放大，可以有效地與帶負(fù)電荷的寡核苷酸結(jié)合。
通常先利用一定濃度的鹽去除無DMT保護(hù)的雜質(zhì)，然后在柱上利用酸洗脫三苯甲基（Detritylation），最后利用不同的鹽濃度把目的寡核苷酸分離純化。純化后的樣品需要脫鹽和濃縮（沉淀或TFF）。
04 層析介質(zhì)的選擇
PolyGel 15Q/30Q陰離子交換層析純化寡核苷酸PolyGel 15Q 產(chǎn)品詳情
科諾賽的PolyGelTM 15Q、PolyGelTM 30Q 是以聚合物PS-DVB（聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物）為基質(zhì)的陰離子交換層析介質(zhì)，具有15μm 和 30μm的小粒徑，采用特殊的功能基團(tuán)修飾方法，專為小核酸類藥物的純化量身打造，具有極高的分辨率、操作空間大、載量高，即使在變性條件（pH 12）下，依然可對寡核苷酸樣品進(jìn)行純化，有效避免了單鏈自互補(bǔ)或富含GC寡核苷酸的聚集現(xiàn)象，特別適合寡核苷酸的精純。
使用PolyGel 15Q 陰離子交換層析介質(zhì)純化寡核苷酸，經(jīng)過一步純化，純度可達(dá)96%以上，回收率85%~90%，完全滿足其質(zhì)量要求。
備注：除了PolyGel 15Q，PolyGel 30Q 也是一款優(yōu)選的寡核苷酸純化填料，具體可根據(jù)需要純化樣品的分子大小、序列、電荷等方面來擇優(yōu)選擇。
目前，高質(zhì)量的寡核苷酸生產(chǎn)能力和穩(wěn)定的供應(yīng)鏈，在國內(nèi)一直處于比較稀缺的狀態(tài)。將寡核苷酸最終產(chǎn)物與其及為相似的雜質(zhì)進(jìn)行分離純化，一直是制約寡核苷酸高質(zhì)量、批量化生產(chǎn)的難點(diǎn)之一。
科諾賽生物作為國內(nèi)純化領(lǐng)域的后起之秀，迎難而上，結(jié)合自主創(chuàng)新的技術(shù)，深入研究，充分考慮產(chǎn)品純度和回收率之前的平衡，通過不同批次的樣品，以及不同規(guī)模下進(jìn)行多次實(shí)驗驗證，可以做到在保證樣品收率85%以上的同時，將其純度做到95%以上，為客戶提供高效的寡核苷酸純化解決方案，幫助客戶解決在生產(chǎn)制備過程中的難題。
產(chǎn)品特點(diǎn)
》15μm和30μm兩種小粒徑可供選擇，分辨率高，載量高，操作空間大，滿足寡核苷酸多樣的純化需求；
》以聚合物PS-DVB為基質(zhì)，具有熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性，可實(shí)現(xiàn)多種技術(shù)的應(yīng)用；
》在高溫下運(yùn)行可以加快傳質(zhì)，提高長鏈寡核苷酸的分離度
》高pH等變性條件下不影響純化，有效避免在修飾、自我互補(bǔ)和富含 GC 的寡核苷酸聚集；
》性能優(yōu)良，容易放大，使用成本低，可滿足從實(shí)驗室到工業(yè)化生產(chǎn)不同規(guī)模的需求。
附錄：2023年1-11月國內(nèi)核酸藥物領(lǐng)域融資情況
