超大孔填料在病毒樣顆粒（VLP）疫苗純化中的應(yīng)用
VLP作為一個更具前景的載體工具，被廣泛應(yīng)用于基因治療、疫苗研發(fā)和診斷等領(lǐng)域。相對于傳統(tǒng)疫苗，VLP疫苗的安全性更高、免疫效果更好。在VLP疫苗的大規(guī)模生產(chǎn)中，下游層析工藝對最終產(chǎn)品的穩(wěn)定性、安全性及有效性起到至關(guān)重要的作用。
VLP的特別之處
VLP（Virus Like Particle），病毒樣顆粒，來源于病毒的外層衣殼蛋白，由一種或者多種衣殼蛋白組分自動組裝形成的納米級別的微小顆粒。VLP顆粒由病毒衣殼蛋白自組裝而成，不含有病毒基因組，此特殊的空間結(jié)構(gòu)能強烈地刺激人體的免疫系統(tǒng)，有效地誘導人體產(chǎn)生免疫保護反應(yīng)。其優(yōu)勢如下：
安全性高：VLP不含復制酶和編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白的核酸，缺乏復制能力，不會傳染，安全性有保障；
免疫效果好：VLP作為大小在40 - 200nm的抗原，可迅速排入淋巴結(jié)（LNs），并與抗原提呈細胞（APCs）和B細胞相互作用，有效刺激B細胞和T細胞反應(yīng)。
表達系統(tǒng)多樣性：大腸桿菌、酵母、哺乳動物細胞、昆蟲細胞和植物等多種表達體系可用于表達VLP。
技術(shù)成熟，已經(jīng)商業(yè)化：據(jù)文獻資料顯示，目前已上市的基于VLP病毒樣顆粒的疫苗有包括2價、4價、9價的人乳頭瘤病毒（HPV）疫苗、乙型肝炎病毒（HBV）疫苗、戊型肝炎病毒（HEV）疫苗以及瘧疾疫苗。更多基于VLP的候選疫苗正在進行臨床前和臨床試驗。
VLP的包膜結(jié)構(gòu)
VLP主要分為eVLP和非包膜VLP，兩者最大的區(qū)別就是在蛋白質(zhì)衣殼外是否有一層包膜。
非包膜VLP：由單個或多個衣殼蛋白組成的結(jié)構(gòu)相對簡單的 VLP，可以在原核和低級真核系統(tǒng)中表達，例如：戊肝病毒、HPV病毒、手足口病毒。
包膜VLP（eVLP）：以矩陣形式包裹在來源于宿主的含有糖蛋白的脂膜中，結(jié)構(gòu)復雜，構(gòu)建難度大，但可設(shè)計性更強。通常在真核表達系統(tǒng)表達，需要共表達幾種結(jié)構(gòu)蛋白用于細胞內(nèi)的自組裝過程。例如：乙肝病毒、流感病毒、冠狀病毒。
VLP疫苗純化中的挑戰(zhàn)
VLP疫苗盡管優(yōu)勢明顯，市場潛力巨大，但是目前仍然存在某些方面的局限及困難，尤其是產(chǎn)品純化方面，VLP 的宿主細胞衍生膜能夠整合抗原和佐劑，與此同時，也存在多種與工藝相關(guān)的宿主細胞雜質(zhì)，產(chǎn)品收率低（特別是包膜VLP），加上縮短上市時間及高昂的開發(fā)成本等壓力，都在一定程度上導致了工藝開發(fā)的不足，為下游工藝開發(fā)帶來了極大的挑戰(zhàn)。
目前市場上已有的純化工藝，大都采用普通的層析介質(zhì)，或多或少都有一定的局限性。
與其他生物分子相比，VLP病毒顆粒最大的特點在于其多聚亞基的大顆粒結(jié)構(gòu)，且分子尺寸較大（直徑20~800nm），普通的瓊脂糖微球和聚合物微球孔徑較小，病毒顆粒不能有效的進入微球內(nèi)部而導致結(jié)合載量及其低，同時狹窄的孔徑會導致其以擴散的方式通過，傳至速度慢，處理量低，耗時長，且會破壞病毒顆粒的結(jié)構(gòu)使其解聚，活性降低，從而影響回收率。
科諾賽經(jīng)過充分的市場調(diào)研，聚焦VLP純化中的難點，結(jié)合自有的超大孔色譜分離技術(shù)（孔徑大于200nm），提出了VLP純化的解決方案，并成功地實踐應(yīng)用，為客戶解決了問題。
VLP疫苗純化推薦方案
純化策略的主線 - 澄清、捕獲、純化和精純。
在收獲和裂解細胞后，為了確保去除污染的細胞碎片和聚集體，需要進行澄清。為了獲得完整和更純凈的VLP，需要再進一步分離純化。
病毒樣顆粒 VLP的下游純化工藝因表達體系的不同，存在不同的純化策略，其中Crysto Shell 700 / 400復合模式層析填料和MoSphere 50V Q / DEAE超大孔層析介質(zhì)，因其獨特的結(jié)構(gòu)特點在 VLP 純化工藝開發(fā)中占據(jù)優(yōu)勢地位。
VLP粒徑較大，優(yōu)先考慮Crysto Shell 700，VLP粒徑較小，優(yōu)先考慮Crysto shell 400，具體需要根據(jù)試驗結(jié)果平衡收率和純度來綜合考慮。
而在精純步驟，由于病毒顆粒較大，MoSphere 50V Q / DEAE超大孔層析介質(zhì)，是最佳選擇。
VLP純化 方案一
第①步 復合模式層析純化：
使用Crysto Shell 700 / 400（陰離子交換與疏水雙重功能）復合模式層析介質(zhì)，吸附宿主細胞雜質(zhì)，VLP分子量大，排阻在外直接流穿，此步驟可以去除 85% 的宿主蛋白。
PS：Crysto Shell 相比 Capto Core 孔徑更小，可確?；厥章?。
第②步 離子交換層析純化：
使用MoSphere 50V Q / DEAE超大孔陰離子交換層析介質(zhì)，進行精純。
VLP純化 方案二
第①步 復合模式層析純化：
使用AdMix Chromrose FF（陰離子交換與疏水雙重功能）復合模式層析介質(zhì)，吸附宿主細胞雜質(zhì)，VLP分子大，排阻在外直接流穿，此步驟可以去除 80% 的宿主蛋白。（VLP粒徑＞80nm適用）
第②步 離子交換層析純化：
使用MoSphere 50V Q / DEAE超大孔陰離子交換層析介質(zhì)，進行精純。
PS：此方案較【方案一】成本更低，可作為節(jié)省成本的替代方案。
包膜VLP純化應(yīng)用案例
項目背景： 客戶樣品為有包膜的病毒抗原VLP疫苗，篩選了市場上多家填料均無法滿足要求，只有某進口品牌的強陰離子介質(zhì)能夠滿足其結(jié)合要求，沒有流穿，但載量較低。 客戶更換為科諾賽超大孔離子交換介質(zhì)后，在高鹽的情況下，不僅結(jié)合性好，載量也有所提升，完全能夠?qū)崿F(xiàn)填料國產(chǎn)化替代。
科諾賽產(chǎn)品：MoSphere 50V Q 超大孔陰離子交換介質(zhì)
項目進展：中試 。
測試結(jié)果：
采用科諾賽 MoSphere 50V Q 超大孔離子交換介質(zhì)，在高鹽條件下上樣，沒有流穿出現(xiàn)。
VLP疫苗純化的方案不止以上這幾種，來自同一家族病毒的VLP可能具有復雜的表面特性。例如，不同毒株的流感VLP在表面抗原上有差異，這就需要因地制宜地調(diào)整純化策略。
總的來說，科諾賽的MoSphere 50 系列超大孔層析填料，在病毒顆粒（VLP）疫苗下游分離純化工藝中是必不可少的、最有效的分離載體之一。
匹配市場需求的產(chǎn)品才有價值
科諾賽的超大孔填料，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于病毒、VLP、AAV載體、質(zhì)粒、外泌體、mRNA及超大蛋白分子的分離純化中，并且充分顯示出了其在純化方面的優(yōu)越性，成功了幫助客戶解決了一個個純化難題，切實地幫助客戶實現(xiàn)降本增效。
