超螺旋質(zhì)粒DNA純化方案

隨著生物醫(yī)藥行業(yè)的不斷發(fā)展，我國(guó)細(xì)胞與基因治療領(lǐng)域研發(fā)與應(yīng)用正加速崛起，高質(zhì)量、高純度的質(zhì)粒DNA是細(xì)胞和基因治療過程中的關(guān)鍵組成部分，質(zhì)粒的純度會(huì)嚴(yán)重影響到轉(zhuǎn)染的效率，如果質(zhì)粒不純，其含有的雜質(zhì)會(huì)嚴(yán)重影響轉(zhuǎn)染復(fù)合體的形成。

如何提取高純度的質(zhì)粒DNA

質(zhì)粒DNA基因治療藥物是以質(zhì)粒DNA為載體的基因治療產(chǎn)品，一般選擇大腸桿菌作為宿主細(xì)胞，提取出的質(zhì)粒中DNA會(huì)以多種形式出現(xiàn)：超螺旋質(zhì)粒DNA (scDNA) 、開環(huán)DNA (ocDNA) 、線性DNA 和質(zhì)粒DNA聚集體等。另外，還伴隨有宿主蛋白 (HCP) 、宿主核酸 (HCD) 、RNA、內(nèi)毒素等雜質(zhì)。其中超螺旋質(zhì)粒DNA（scDNA）是我們的目標(biāo)產(chǎn)物，因?yàn)樗霓D(zhuǎn)染和表達(dá)效率最高，然而其他DNA雜質(zhì)也有與scDNA非常相似的純化特點(diǎn)，所以獲得高純度的質(zhì)粒產(chǎn)物需要一個(gè)穩(wěn)定有效的解決方案。

質(zhì)粒純化最好的方案是要有一個(gè)穩(wěn)健有效的整體過程，其中每一步都能得到很好的優(yōu)化。目前市場(chǎng)上應(yīng)用比較更廣泛的是經(jīng)典的層析三步法，科諾賽生物對(duì)每一步層析工藝進(jìn)行了優(yōu)化，將不同原理的層析純化技術(shù)、合適的層析介質(zhì)結(jié)合在一起，進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)應(yīng)用研究，可保證在高純度的基礎(chǔ)上，工藝更加的穩(wěn)定及高效。

超螺旋質(zhì)粒DNA純化三步法：

第1步 捕獲質(zhì)粒DNA，去除RNA

（凝膠過濾層析  Chromrose 6FF）

第2步 去除ocDNA

（親和層析  Plasmid Chromrose HP）

第3步 去除痕量雜質(zhì)及內(nèi)毒素

（離子交換層析  MoSphere 50M Q）

質(zhì)粒DNA純化方案及案例解析

第一步 凝膠過濾層析純化：捕獲質(zhì)粒DNA，去除RNA

使用Chromrose 6FF凝膠過濾層析介質(zhì)進(jìn)行第一步純化，主要去除大量RNA和宿主蛋白等小分子雜質(zhì),根據(jù)分子大小的不同對(duì)不同的組群進(jìn)行分離，由于質(zhì)粒DNA和RNA的分子量差異很大，因此上樣量可以達(dá)到0.3CV，在純化時(shí)可同步進(jìn)行緩沖液置換，直接與第二步親和層析純化進(jìn)行無縫對(duì)接。

實(shí)驗(yàn)條件

樣品：濃縮20×澄清堿性裂解液

層析柱：HiQumn CTN 30

層析介質(zhì)：Chromrose 6FF

上樣量：0.3CV

緩沖液：2.1 M (NH4)2SO4，10 mM EDTA， 100 mM Tris-HCl，pH 7.5

凝膠過濾層析純化結(jié)果：Chromrose 6FF 回收率≥95%，電泳結(jié)果顯示樣品去除RNA≥95%。      

第二步 嗜硫親和層析純化：去除開環(huán)質(zhì)粒(ocDNA)

使用Plasmid Chromrose HP嗜硫親和層析介質(zhì)進(jìn)行第二步純化，ocDNA和scDNA分子性質(zhì)高度相似，其中scDNA具有更高的堿基暴露程度和表面電荷，Plasmid Chromrose? HP嗜硫親和介質(zhì)利用本身的特性可以特異性得將ocDNA和scDNA分開，提高質(zhì)粒的均一性。經(jīng)過這兩步層析純化后，scDNA的純度可以提高到90%以上。

實(shí)驗(yàn)條件

樣品：Chromrose 6FF后的質(zhì)粒DNA                   

層析柱：HiQumn CTN 30

層析介質(zhì)：Plasmid Chromrose HP

平衡緩沖液：2.0M (NH4)2SO4，10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH7.5

洗脫緩沖液：0.3M NaCl，1.7 M (NH4)2SO4，10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH7.5

注意：不同序列及大小的質(zhì)粒，純化時(shí)緩沖液及載量要適當(dāng)調(diào)整。

親和層析純化結(jié)果：Plasmid Chromrose HP 回收率可達(dá)90%，電泳結(jié)果顯示可實(shí)現(xiàn)對(duì)ocDNA和scDNA的完全分離，可獲得純度≥95%的scDNA。   

第三步 離子交換層析純化：去除痕量雜質(zhì)及內(nèi)毒素  

使用MoSphere 50M Q 陰離子交換層析介質(zhì)進(jìn)行第三步精純，去除痕量雜質(zhì)和內(nèi)毒素。經(jīng)過前兩步層析純化后，scDNA純度和均一性基本滿足了生產(chǎn)需求，但依然存在內(nèi)毒素的隱患，此步驟主要是利用內(nèi)毒素在高鹽條件下不與介質(zhì)結(jié)合的原理，除去樣品中的內(nèi)毒素，PolyGel 30Q的對(duì)本樣品質(zhì)粒收率有85%。

實(shí)驗(yàn)條件

樣品：Plasmid Chromrose HP后的質(zhì)粒DNA                   

層析柱：HiQumn CTN 30

層析介質(zhì)：MoSphere 50M Q 

平衡緩沖液：0.4M NaCl，10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH7.5

洗脫緩沖液：1.0M NaCl，10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH7.5

離子交換層析純化結(jié)果： MoSphere 50M Q 對(duì)樣品的回收率約為83%，內(nèi)毒素含量1.2EU/mg(scDNA)

總結(jié)：

科諾賽生物的質(zhì)粒純化三步法被證實(shí)是穩(wěn)健有效的方案，實(shí)用性強(qiáng)。隨著工藝的不斷發(fā)展，我們也會(huì)不斷的去優(yōu)化工藝、升級(jí)產(chǎn)品，幫助客戶提高生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本，切實(shí)地為國(guó)內(nèi)的細(xì)胞與基因治療出一份力。