常用的抗體純化方法

抗體純化方法的選擇一般取決于抗體的來源、時間的需求、成本的預算以及抗體的最終用途等。本篇文章介紹了以色譜純化法為主的四大純化方法，包括了親和層析法、離子交換層析法、尺寸排阻色譜法和疏水作用色譜法。

一．親和層析法

親和純化是一種具有可逆反應的生化分離純化技術，如抗原與抗體。適用于從成分復雜且雜質(zhì)含量遠大于目標物的混合物中提純目標物。如圖1所示，瓊脂糖首先與介質(zhì)偶聯(lián)，結合成具有特異親和性的分離介質(zhì)，再加入成分復雜的混合物也就是樣品，配體選擇性吸附生物活性物質(zhì) (高親和力抗體)，平衡液清洗雜質(zhì)，最終洗脫獲得目標抗體。

圖1.親和層析示意圖

Protein A，Protein G與Protein A/G抗體純化法

20世紀70年代初期，細菌蛋白開始作為純化免疫球蛋白的方法出現(xiàn)。細菌蛋白對抗體的高親和力使其成為用于檢測和純化抗體一種強有力的工具。其中，金黃色葡萄球菌蛋白A (staphylococcal protein A) 和鏈狀球菌蛋白G (streptococcal protein G) 是最為常見的兩種用于純化全長抗體的配體，它們能夠與不同物種或不同親和力的抗體結合。

金黃色葡萄球菌蛋白A，簡稱protein A，來源于革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌表面。天然的protein A含有5個同源免疫球蛋白 (大多數(shù)為IgG) 結合域（E, D, A, B和C）可以與抗體的Fc區(qū)特異性結合 (CH2與CH3之間)。此外，protein A也可結合抗體重鏈可變區(qū)的CDR2與CDR3之間。Protein A的分子大小約為42kDa，對于大部分物種的IgG都具有較高的親和力。研究表明，一個protein A分子可以同時結合至少2個IgG分子。天然protein A作為配體被偶聯(lián)在瓊脂糖介質(zhì)上，這樣它的結合域便可用來捕捉和結合IgG。雖然天然protein A與IgG的親和力很強，但它會和非目的蛋白結合，則最終會導致蛋白的純度下降，因此達不到標準。于是，重組protein A在基于天然protein A的基礎上進行了一定程度的基因工程技術改造，但這并不影響重組protein A對于免疫球蛋白Fc區(qū)的特異性，在增強其抗體的結合能力同時，純化效果也得到了顯著地提高。

圖2. Protein A結構

鏈狀球菌蛋白G，簡稱protein G，是一種來自鏈狀球菌的細胞壁蛋白。分子量約為25kDa。由三個白蛋白結合域 (ABD1, ABD2, ABD3) 和免疫球蛋白結合域構成。與protein A相似，protein G可與IgG的Fc區(qū)特異性結合，但是protein G能夠特異性結合的抗體種類更加廣泛，對于非常見物種IgG的結合能力也比較好，血清蛋白結合水平更低，純度也更高。重組protein G使用基因重組技術經(jīng)E.coli發(fā)酵生產(chǎn)的重組鏈狀球菌蛋白，人工除去了白蛋白結合域和細胞表面結合域，以減少非特異性結合，因此，它比天然protein G和protein A有更強大的親和力。

圖3. Protein G結構

總的來說，protein A和protein G各具特點。經(jīng)過改造的重組protein A與瓊脂糖介質(zhì)的多位點結合保證其耐受力，因而可以在惡劣洗脫條件下最高程度地保持配體不脫落。Protein G能夠結合大多數(shù)哺乳動物的IgG，并且具有更高的親和力 (其中人源和鼠源的抗體最為顯著) 但卻不能像protein A一樣可以經(jīng)受住嚴苛的洗脫條件。

Protein A/G是一種基因工程結合蛋白，通過基因工程方法將protein A與protein G分子中與IgG的Fc區(qū)結合域的基因融合，表達為融合蛋白。它由4個protein A和2個protein G免疫球蛋白結合域組成，分子量大約為40-50 kDa，比單獨的protein A或protein G結合范圍更加廣泛，并將其優(yōu)點融為一體，幾乎可以應用于所有種屬的IgG純化

抗原親和純化法

利用抗原為配體的親和純化被稱之為抗原親和純化，是一種高度純化蛋白類生物大分子的有效手段。使用這種方法，抗原將替代親和配體，被化學偶聯(lián)在凝膠介質(zhì)上。為了建立親和層析，需要大量的純化抗原，由于抗原非常特殊，這意味著可能需要自己合成或純化抗原，同時也要注意確保獲得抗原性。目標抗體將特異性結合抗原，最終洗脫獲得目標抗體。

抗原親和純化法與Protein A純化法最大區(qū)別在于，前者是與抗體的Fv區(qū)特異性結合，后者則是與抗體的Fc區(qū)特異性結合。相較之下，抗原親和純化能夠高度識別和結合目標抗體，因此也多用于從多克隆抗體中純化抗原特異性的抗體。

圖4. 抗體親和純化柱原理示意圖

固定化金屬螯合親和層析法

固定化金屬螯合親和層析通過螯合固定的金屬離子與蛋白質(zhì)之間的親和作用，分離并純化蛋白質(zhì)。瓊脂糖作固定相偶聯(lián)螯合劑亞氨基二乙酸，亞氨基二乙酸的鈉鹽與金屬離子螯合后，過渡金屬離子(Cu2+、Co2+、Zn2+、Ni2+)將與蛋白質(zhì)表面的一些氨基酸(組氨酸、色氨酸或半胱氨酸)配位結合，不同的蛋白質(zhì)與金屬離子的結合力不同，從而達到將蛋白質(zhì)分離的目的。

它與其他的親和純化技術相比，配體穩(wěn)定性高，吸附量大，洗脫條件溫和，但同樣也更加復雜，因為需要額外的步驟固定金屬離子。不同的金屬離子都可以螯合到柱上，如此相同的吸附劑對于不同的金屬離子就能產(chǎn)生不同的吸附性選擇。因此，選擇合適的金屬離子種類對獲得最佳的分離效果也是至關重要的。

附加表位作為抗原決定簇更為人所知。然而，poly-His (HHHHHH)，C-myc (EQKLISEEDL)，F(xiàn)LAG (DYKDDDDK)，血凝素 (YPYDVPDYA)，T7 (MASMTGGQQMG) 和Glu-Glu (EYMPME) 等短氨基酸序列也可以用于重組抗體的純化。這些短序列通過PCR(聚合酶鏈式反應)的方式被添加在抗體序列的末端。Poly-His無疑是用于純化重組抗體的最普遍使用的親和標簽。組氨酸與過渡金屬離子形成復合物，結合是pH依賴性的，這可以用于基于IMAC純化的His-標記蛋白質(zhì)的洗脫。盡管在E.coli中基于poly-His-標簽蛋白質(zhì)的純化可以產(chǎn)生高達90%純度的蛋白質(zhì)，但昆蟲和哺乳動物細胞中較高百分比的組氨酸殘基可導致背景污染物的明顯增加。由于它們較小的尺寸，比起其他較大的對應物具有較少的空間位阻，因此表位親和標簽可以更有利于蛋白質(zhì)純化。

二．離子交換層析法

離子交換層析是一種較為常見并被廣泛使用的抗體純化方法。帶有電荷的溶質(zhì)分子，可與帶有相反電荷的固定化離子交換基團之間發(fā)生可逆的相互作用。

抗體是蛋白質(zhì)，由兩性物質(zhì)氨基酸組成，其中包括了一些具有酸性或堿性功能的側鏈，能夠在一定的pH緩沖液中電離為離子。等電點pI一般作為離子交換層析實驗條件選擇的標準。通常根據(jù)離子交換固定相的性質(zhì)分為陰離子交換層析與陽離子交換層析兩種?？贵w在低于其等電點的pH環(huán)境時，以堿性離解為主，呈陽離子狀態(tài)，帶有正電荷，可與陽離子交換劑結合。相對的，抗體在高于其等電點pH環(huán)境時，以酸性離解為主，呈陰離子狀態(tài)，帶有負電荷，可與陰離子交換劑結合。被分離物質(zhì)對固定化離子交換基團的親和力不同，因此可以通過改變緩沖液的離子強度與pH值，從而達到分離抗體的目的。

圖5. 陰陽離子交換示意圖

三．尺寸排阻色譜法

尺寸排阻色譜法可用于DNA，蛋白質(zhì)的純化，緩沖液更改，脫鹽等。它是一種溫和的分離方法，尺寸排阻的分離原理取決于分子在溶液中的體積。當溶液加入純化柱時，分子會依照其在溶液中的尺寸(分子平均直徑)從大至小依次分離。分子小的通過柱床流動速度相對緩慢，因為它們會不同程度的深入孔隙，而大的分子由于不能進入柱床而被快速排出。因此，通過分子體積大小洗脫樣品，可以有效地進行分選。

尺寸排阻色譜一般可分為兩種類型，凝膠滲透色譜和凝膠過濾色譜，分別以有機溶劑和水為流動相。凝膠滲透色譜使用疏水柱填充材料和非水性流動相來測量合成聚合物的分子量分布；凝膠過濾色譜則使用親水包裝材料和水性流動相來分離，分餾或測量可溶于水的分子的分子量分布?？偟膩碚f，尺寸排阻可以去除低分子量污染物，但由于其低生產(chǎn)率，這種方法并不適用于純化抗體的大批量生產(chǎn)，但它仍是小規(guī)模純化IgM，去除IgG與IgM中聚集體，和分析它們的可靠選擇。

圖6. 尺寸排阻色譜柱

四．疏水作用層析法

疏水作用層析法是利用鹽-水體系中樣品分子的疏水基團和層析介質(zhì)的疏水配基之間疏水力的不同而進行分離的一種層析方法。這種方法利用被分離組分分子表面的疏水微區(qū)，變形后暴露出的疏水殘基，或在高鹽環(huán)境下暴露于分子表面的疏水殘基與固定相的疏水性配體之間的作用強弱，依次用從高至低離子強度洗脫液可將疏水用作由弱至強的組分分離。

單克隆抗體由于其分子中有許多非極性氨基酸，暴露于抗體分子表面的非極性氨基酸側鏈可以密集在一起形成疏水區(qū)，起到穩(wěn)定抗體的三，四級結構的作用。不同單抗疏水區(qū)的強弱有著較大的差異。溶液鹽濃度增加，疏水作用將變得更強，因此，大多數(shù)疏水作用層析都是在高鹽濃度條件下上樣，低鹽濃度進行洗脫。疏水作用介質(zhì)的重要特點是疏水性弱，與蛋白質(zhì)的作用比較溫和，所以能夠更好地保持生物大分子的天然結構和生物活性，同時疏水作用也非常擅長從大體積樣品中提取低含量的目標蛋白。