Fc融合蛋白及純化方法

一、什么是FC融合蛋白？

Fc融合蛋白是利用基因工程技術(shù)，把免疫球蛋白的Fc段結(jié)合到某種具有生物學(xué)活性功能的蛋白分子上而形成的一種新型的重組蛋白，為原來的功能蛋白附加了抗體的性質(zhì)。

二、Fc融合蛋白有哪些優(yōu)點？

1. 長效性

這類蛋白制成的藥物在血漿內(nèi)有比較長的半衰期，F(xiàn)c 片段通過 CH2-CH3 與 FcRn 結(jié)合并呈 pH 依賴性：在 pH 7.4 的生理條件下，F(xiàn)cRn 與Fc 不結(jié)合；在細胞內(nèi)涵體 pH 6.0~6.5

2. 穩(wěn)定性

Fc融合蛋白可以通過 Fc 鉸鏈區(qū)的二硫鍵連接形成穩(wěn)定的二聚體，進一步通過對二硫鍵的基因工程改造和修飾，還可以使 Fc 融合蛋白聚集成六聚體復(fù)合物。Fc 區(qū)域可以獨立折疊，保證伴侶分子體內(nèi)外的穩(wěn)定性。

三、FC融合蛋白的純化方法是什么？

由于FC融合蛋白具有與抗體相似的FC端，因此可以采用抗體純化方式進行純化。目前應(yīng)用最廣泛的抗體純化方法是親和層析和離子交換層析方法。

由于Protein A具有結(jié)合抗體FC端的天然特異性，而重組Protein A又具有耐堿性突變性，所以給工業(yè)化分離純化抗體提供了幫助。通過第一步親和捕獲、第二步陰離子交換層析中度純化和第三步陽離子交換層析精純方式，可以獲得純度較高的FC融合蛋白。但由于FC融合蛋白穩(wěn)定性較差，在溶液中存在大量聚集體，較易發(fā)生結(jié)構(gòu)折疊，這就導(dǎo)致在純化FC融合蛋白過程中收率一直很低，即便使用高載的親和填料，其載量也就在20mg/ml左右，因此在FC融合蛋白的分離純化過程中，高載的親和填料優(yōu)勢并不顯著。

科諾賽生物研發(fā)生產(chǎn)Protein A ChromroseTM 親和層析介質(zhì)（圖1）的以高度交聯(lián)的瓊脂糖為基球，利用特有的微球改性技術(shù)以增強其機械強度， 使其在載量、流速、耐堿性、配基脫落、HCP殘留、純度、回收率等方面有明顯優(yōu)勢。

圖1. 科諾賽生物Protein A ChromroseTM 親和層析介質(zhì)

四、Fc融合蛋白的應(yīng)用領(lǐng)域有哪些？

1、藥物領(lǐng)域

常規(guī)的蛋白類藥物由于其在血漿內(nèi)半衰期短，因此要進行長時間大劑量的給藥，從而產(chǎn)生嚴重的不良反應(yīng)，而Fc融合蛋白可以顯著提高藥物的半衰期，而且可以通過改良進獲得更長的時間，比如阿斯利康的 Motavizumab-YTE 突變體的 Fc 段含有3個突變： “YTE”，即 252、254 和 256 位的蛋氨酸、絲氨酸和蘇氨酸分別被酪氨酸、T 和谷氨酸替換，Ⅰ期臨床研究證實本品在健康人體內(nèi)的血漿半衰期達到100天，約為 Motavizumab 原型的 2~4 倍，而清除率僅為原型的 71%~86%。

截止2019年，由FDA批準上市的Fc融合蛋白類藥物主要有7種，都是通過重組內(nèi)源性多肽或其突變體與Fc片段融合而成，其中大部分涉及自身免疫性疾病的治療；在表達方式上，除了少數(shù)使用用大腸桿菌外，其余都是通過哺乳動物細胞表達。

FDA批準的Fc融合蛋白類藥物

2、疫苗領(lǐng)域

Fc融合蛋白的功能蛋白部分可以是細胞因子、毒素、受體、酶、抗原肽等，因此我們可以通過一系列方法得到相應(yīng)的抗原以后加上Fc段作為抗原的運載工具，靶向結(jié)合上APC（表面能表達FcR），縮短抗原在血漿中的游離時間，減少蛋白酶對抗原的降解，提高抗原半衰期，從而加強抗原的呈遞。隨著細胞內(nèi)能夠結(jié)合Fc并影響免疫反應(yīng)的受體蛋白不斷被發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)c融合蛋白類疫苗能結(jié)合的受體將不僅僅局限于APC，應(yīng)用前景也將大大擴展。

其他應(yīng)用 Fc融合蛋白穩(wěn)定性相較于單一的功能蛋白更好，并且可以通過Fc與Pprotein A/G的結(jié)合作用，將Fc融合蛋白綁定在連有Protein A/G的固相載體上，構(gòu)建蛋白微陣列或微球，從而捕獲復(fù)雜組分（血液、組織液、細胞裂解液等等）中能與之特異性結(jié)合的待測蛋白，以探索蛋白之間的相互作用。